Om prosjektet
Cellefritt DNA (cfDNA) består av korte DNA fragmenter som frigjøres fra celler hovedsakelig gjennom apoptose, men også nekrose eller sekresjon. Disse DNA fragmentene sirkulerer i kroppsvæsker, deriblant blodet, og har fått økende betydning innen moderne diagnostikk, blant annet til å oppdage sykdommer som kreft. Ved å innhente genetisk informasjon fra cfDNA i kroppsvæsker med en såkalt flytende biopsi, som for eksempel en blodprøve, så unngås de invasive inngrepene som kan være nødvendig i en vanlig biopsi. I dette prosjektet undersøker vi hvor effektivt to ulike kommersielle metoder ekstraherer cellefritt DNA fra blodprøver. Formålet er å vurdere kvaliteten på det isolerte cfDNA, samt å identifisere hvilken metode som er best egnet for videre utvikling og implementering i sykehusets analysemetoder.
Siden cfDNA forekommer i svært lave konsentrasjoner er det mer sårbart for tap og forurensning enn vanlig genomisk DNA under prøvehåndtering. Tilstedeværelsen av annet DNA kan overskygge signalet fra cfDNA og gi misvisende resultater. For å sikre pålitelige analyserer det derfor avgjørende at ekstraksjonsmetoden som benyttes gir høyt utbytte, samtidig som fragmentintegriteten bevares.
Metodene ble sammenlignet med hensyn til total cfDNA mengde, evnen til å bevare korte fragmenter, samt grad av kontaminasjon, og egnethet for klinisk bruk. Til kvantifisering og kvalitetsvurdering ble droplet digital PCR (ddPCR) benyttet. Polymerase chain reaction (PCR) er en teknikk som brukes til å kopiere opp spesifikke DNA-sekvenser slik at de kan måles og analyseres. I ddPCR deles prøven opp i tusenvis av små dråper, hvor hver dråpe fungerer som en individuell PCR- reaksjon. Dette gjør det mulig å telle antall DNA-kopier svært nøyaktig uten standardkurve gjennom såkalt absolutt kvantifisering, og dermed vurdere både mengde og kvalitet på DNA-et med høy presisjon og sensitivitet.
Etter ekstraksjon så testet vi flere gener med ddPCR for å evaluere ekstraksjonseffektivitet og identifisere eventuell kontaminasjon fra genomisk DNA. Resultatene fra prosjektet kan bidra til optimalisering av laboratoriemetoder innen molekylær diagnostikk, og legger til rette for utvikling av mer presise og skånsomme diagnostiske verktøy i fremtidens helsevesen.
Bilder:
- Droplet generator for ddPCR med ferdig fylt kassett med prøver, klar for dråpe generering.
- Pipettering før ddPCR.
Prosjektdeltakere
Jakob Jokubas Sendzikas, Lasse Martinsen Wisnes, og Erik Magnus Nedland Henriksen
Om oppdragsgiveren
Oppgaven er utført i samarbeid med Seksjon for genteknologi og infeksjonsserologi ved Sykehuset Østfold, som er en del av Senter for laboratoriemedisin ved Sykehuset Østfold, Kalnes. Seksjonen utfører spesialisert laboratoriediagnostikk basert på molekylærbiologiske og serologiske metoder, herunder analyser av nukleinsyrer (DNA og RNA) og antistoffbaserte undersøkelser. Dette omfatter blant annet mutasjonsanalyser innen kreftdiagnostikk, HPV-testing og påvisning av andre infeksjonssykdommer. Den serologiske delen av seksjonen fokuserer på påvisning og kvantifisering av spesifikke antistoffer, som gir informasjon om pågående eller gjennomgått infeksjon, samt immunstatus.
Veileder
Alba Kaci, Sykehuset Østfold
Lars Oliver Baumbusch, Høgskolen i Østfold